Seminarium Zakładu Biofizyki

Metoda nadekspresji rekombinowanych białek w komórkach bakteryjnych Escherichia coli to najpowszechniej stosowana technika uzyskiwania dużych ilości białek potrzebnych do różnorodnych badań, w tym badań biofizycznych. Często białko rekombinowane występuje w fuzji ze znacznikem (np. His-tag) lub innym białkiem (np. GST), co umożliwia wydajne oczyszczanie technikami chromatografii powinowactwa. Alternatywną metodą jest oczyszczanie białka nadeksprymowanego w formie ciałek inkluzyjnych, czyli tworzących się w komórkach bakteryjnych agregatów białkowych. Głównymi zaletami tej metody jest ochrona białka przed proteolizą oraz wysoka homogenność ciałek inkluzyjnych - nawet 95% białka może stanowić białko rekombinowane. Podczas oczyszczania białek eIF4E Arabidopsis thaliana wykorzystując stosowany przez nas wcześniej protokół oczyszczania z ciałek inkluzyjnych rekombinowanych białek z rodziny eIF4E napotkaliśmy problem silnego zanieczyszczenia kwasami nukleinowymi otrzymywanego białka. Uzyskane wyniki wskazały, że kwasy nukleinowe najprawdopodobniej występują zarówno na powierzchni ciałek inkluzyjnych, jak i są bezpośrednio wiązane przez białko wewnątrz agregatów. Podczas seminarium zostaną przedstawione techniki, które pozwalają na usuwanie zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi oraz opracowana przez nas metoda, która umożliwiła uzyskanie tych białek wolnych od kwasów nukleinowych.

The method of overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli cells is one of commonly used techniques to obtain large amounts of a protein necessary for biophysical studies. The recombinant protein is often tagged (i.e. with a His-tag) or in fusion with another protein (i.e. GST), to allow high-yield protein purification by means of affinity chromatography. Alternatively, the protein can be overexpressed in inclusion bodies which are protein aggregates formed in bacteria cells. The main advantage of the protein purification from inclusion bodies is protection of the protein against proteolysis, and high homogeneity of the inclusion bodies; the recombinant protein can constitute up to 95% of the total protein amount. In our attempts to purify recombinant Arabidopsis thaliana eIF4Es using the previously utilized protocol for the purification of recombinant eIF4E from inclusion bodies, we observed high contamination of the purified protein with nucleic acids. We found out that nucleic acids probably associate with the surface of inclusion bodies as well as they are directly bound to the protein inside the aggregates. During the seminar, techniques useful for removing nucleic acid contaminants and our method developed to acquire the eIF4E samples free of nucleic acids will be presented.