Seminarium Zakładu Biofizyki

Kompleks Dcp1/2 jest głównym enzymem dekapującym a jego aktywność jest kluczowa dla obiegu mRNA. Kompleks ten jest zbudowany z dwóch podjednostek: Dcp1 jest jednostką regulatorową podczas gdy Dcp2 jest odpowiedzialny za aktywność katalityczną. Sam Dcp2 jest zbudowany z dwóch domen, jedna ma charakter regulatorowy a druga zawiera centrum katalityczne. Pomimo, że Dcp2 jest pirofosfatazą wiążącą się jedynie do łańcucha RNA to jego domena regulatorowa wiąże, ale nie hydrolizuje nukleotydy zawierające m7G. Z tego powodu spekulowaliśmy, że takie związki mogą być inhibitorami Dcp2. Dlatego też wybrano grupę analogów kapu modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym, by wykonać badania przesiewowe pod kątem inhibicji Dcp1/2. Odkryto, że szereg związków posiadających modyfikację tio- lub boranofosforanową jest inhibitorami Dcp1/2. Następnie związek o najsilniejszych właściwościach inhibitorowych, m7GpSpppSm7G został wybrany do dalszych badań kinetycznych i strukturalnych. Eksperymenty NMR pozwoliły na zmapowanie miejsca wiązania i obliczenie powinowactwo do obydwu domen Dcp2. Pomiary kinetyczne wskazały, że wymieniony związek jest mieszanym inhibitorem, posiadającym wyższe powinowactwo do wolnego enzymu niż kompleksu enzym-substrat. Do tej pory jest to pierwszy dowód na to, że małocząsteczkowy ligand jest zdolny do hamowania aktywności Dcp1/2 in vitro.

Dcp1/2 complex is the major decaping enzyme, which is crucial for mRNA turnover. The complex is composed of two subunit: Dcp1 which is a regulatory unit and Dcp2 which is responsible for the catalytic activity. Dcp2 itself comprises two domains, the first one is a regulatory domain and the second one contains the catalytic centre. Despite being a RNA-dependent pyrophosphatase, Dcp2 regulatory domain recognise, but not hydrolyse, m7G-containing nucleotides. Due to that we hypothesised that Dcp1/2 may be inhibited by such compounds. Hence, a number of synthetic cap analogues, bearing various modifications in the phosphate chain, was subjected to an enzymatic screening. It has been found that some of tested compounds, having either thio- or boranophosphate modification, act as Dcp1/2 inhibitors. Then, a most potent inhibitor, m7GpSpppSm7G, was selected to kinetic and structural studies. NMR experiments allowed to map the potential binding site and calculate the affinity to both domains of Dcp2. Kinetic assays indicated that mentioned compound is a mixed inhibitor, which has higher affinity to the free enzyme than to the enzyme-substrate complex. Up to know, this is the first evidence that small-molecule ligand is capable of attenuating Dcp1/2 activity in vitro.