Seminarium Zakładu Biofizyki
sala B2.38, ul. Pasteura 5
2021-12-10 (14:15) 
mgr Katarzyna Grab (Szkoła Doktorska Nauk Ścisłych i Przyrodniczych, Uniwersytet Warszawski)
Nowe narzędzia molekularne do badania procesu dekapingu mRNA
Celem niniejszego projektu było opracowanie metody badania przebiegu procesu dekapingu, opartej na pomiarze intensywności fluorescencji. Zsyntezowano szereg naturalnych i syntetycznych analogów kapu, które następnie zostały wbudowane do nici RNA na drodze transkrypcji in vitro. Zmodyfikowane na 5’ końcu i zawierające sekwencję aptamerową mRNA było oczyszczane z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych. Fluorescencyjny assay składał się z trzech zasadniczych etapów: degradacji enzymatycznej kapowanego mRNA, ponownego zwijania nici mRNA z fluorogenicznym ligandem oraz pomiaru intensywności fluorescencji tak powstałego kompleksu przy użyciu czytnika mikropłytek. Dodatkowym potwierdzeniem skuteczności metody była detekcja pozostałości niezdegradowanego RNA na żelu poliakrylamidowym. Dane uzyskane z eksperymentów pozwoliły na sprofilowanie wybranych enzymów dekapujących pod kątem ich preferencyjności substratowej a opracowana i zoptymalizowana metoda może być zastosowana w dalszych badaniach nad aktywnością enzymów degradujących kap.